吲哚乙酸氧化酶活性的测定

吲哚乙酸氧化酶是一种能够氧化吲哚乙酸的酶。它是含有铁的血红蛋白，以二价锰离子和一元酚为辅因子，参与植物吲哚乙酸的代谢过程，调节吲哚乙酸的水平，从而影响植物的生长。吲哚乙酸分布在生长旺盛的地方，而吲哚乙酸氧化酶则分布在生长不旺盛的部位。在参与氧化的过程中，降解产物包括二氧化碳和3-亚甲基羟吲哚等。酶活的大小，可以通过吲哚乙酸被破坏的速率来表示。检测方法一般采用分光光度法测定。

检测原理：在无机酸存在的情况下，吲哚乙酸和FeCl3发生反应，生成红色的螯合物。该物质在530nm的波长处具有最大的吸收峰，利用这个特点就可以测定吲哚乙酸被氧化的速度了。对标准品进行梯度稀释，并上机检测吸光度值，以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。在同样的条件下，检测样品吸光度值，可以多做几个重复，求取平均值。结合标准曲线，计算出样品中的吲哚乙酸含量，进一步计算吲哚乙酸氧化酶的活性。

开始要做的是吲哚乙酸氧化酶的提取，称取0.3g的玉米幼苗胚芽，加入预冷的磷酸缓冲液1.5mL，冰浴中研磨。取出来4000rpm离心10分钟，取上清液，就是粗酶液了。

氧化实验，取0.5mlMnCl2和0.5ml的2,4-二氯酚，以0.5ml的吲哚乙酸的底物中，加入1ml的酶液，在2.5ml的磷酸缓冲液中，25℃水浴中保温30min，进行反应。空白对照的话，去掉1ml的酶液，其他的都正常程序走下去。

30min后，取2个试管，每个试管中装入0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸（V：V=1:50）混合溶液4ml。再向这2个试管中加入上面反应后的溶液2ml，和空白溶液2ml。这2个试管在40℃保温30min，反应液会呈红色。调节分光光度计，在530nm波长处测OD值。

下面，就是要制作标准曲线。取7个试管，分别加入0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸（V：V=1:50）混合溶液2ml，再加入梯度浓度的吲哚乙酸溶液1ml，以0管溶液调零，分别测定530nm处的吸光度值。以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。计算出样品中的吲哚乙酸含量，这个时候，根据公式计算吲哚乙酸氧化酶的活性。